抗酸化活性測定 – SOD

概要

準備した試料中の Superoxide Dismtase (SOD) 活性を測定します。

準備するもの

  • Working solusions
  • 検量線用SOD標準試薬
  • マイクロピペット 10-200 μL 、ピペットチップ
  • マイクロピペット 100-1000 μL 、ピペットチップ
  • マイクロチューブ
  • キュベット（セミミクロセル）
  • 紫外可視分光光度計
  • 廃液を入れる容器
  • 使用済みチップを入れる容器

Working solutions（Stock solutionsから調整）

  • 890 μL の 50ｍM リン酸緩衝液（PBS）（pH 7.8）
  • 25 μL の 13mM メチオニン溶液
    • stock solution : PBS = 1 : 19 で 20 倍希釈します
  • 25 μL の 75 μM NBT
    • stock solution : PBS = 1 : 39 で 40 倍希釈します
  • 25 μL の 0.1 mM EDTA
    • stock solution : PBS = 1 : 39 で 40 倍希釈します
  • 10 μL の sample solution
  • 25 μL の 2 μM riboflavin
    • stock solution : PBS = 1 : 39 で 40 倍希釈します

手順

  1. マイクロチューブに riboflavin 以外の溶液を入れる
  2. riboflavin を加えた直後に 4000 lux の光の 30 cm 下に 15 分間おく
    1. 光に当てないコントロールもつくる（アルミホイルをまくなどする）
    2. ブランクの試料を入れて光に当てるコントロールもつくる（緩衝液を入れる）
  3. 反応溶液をキュベットにうつし、560 nm の吸光度を測定する
  4. SOD 標準試料の検量線からユニットを計算する

Stock solutions（使用期限は 1 週間）

  • リン酸緩衝液（PBS） 50mM (pH 7.8)
    • りん酸二水素ナトリウム 1.216 g
    • りん酸水素二ナトリウム 5.730 g
    • H2O で 1000 mL にメスアップ
  • メチオニン 520 mM 溶液 10mL
    • 775.90 mg を H2O で 10mL にメスアップ
  • Nitro blue tetrazolium (NBT) 3mM
    • 24.53 mg を H2O で 10mL にメスアップ
  • エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 4mM
    • 2.922 g の EDTA を H2O で 100 mL にメスアップ（100 mM）別にストックしておく
    • 400 μL の 100 mM EDTA に 9.6 mL H2O を加える（4 mM）
  • Riboflavin 80 μL
    • 3 mg を H2O で 10mL にメスアップ（これで 800 μL）
    • 10 倍希釈

参考文献

Krishnan N, Chattopadhyay S, Kundu J, Chaudhuri A (2002) Superoxide dismutase activity in haemocytes and haemolymph of Bombyx mori following bacterial infection. Current Science 321–325